图片来源：David Parkins
RNA分子在人体中承担着信使的角色。通过在细胞间进出，它能够完成机体组织间的信息交流。因此对科学家们而言，通过检测RNA来诊断疾病似乎理所应当。他们认为，通过检测血液、唾液、尿液以及其他体液中携带的RNA分子，就应该可以知晓检测者的健康情况。
但现实情况却复杂得多。“我们在这件事情上，都有点天真了。”加州大学圣迭戈分校（UCSD）的围产学家Louise Laurent表示。
Laurent致力于开发微创性的RNA检测技术，以用于癌症、心脏病、神经退行性疾病以及其他疾病的早期筛查和临床管理。目前越来越多的科学家从事这一领域，但胞外RNA（extracellular RNA, exRNA）的多样性以及RNA运输系统的复杂性，都给这一过程带来了巨大的挑战。“我觉得我们都低估了生物系统的复杂程度。”Laurent表示。她目前正在研究用exRNA来预测妊娠过程中的一些并发症。
RNA的多样性会导致检测时存在大量的分子背景噪音，很难从中辨别出具有临床意义的生物标志物。不仅如此，由于目前存在的技术难题都与exRNA的收集、处理和分析有关，因此不同实验室的实验结果间难以进行比较，而这种比较又恰恰是发现并验证exRNA生物标志物的必需步骤。
以分离胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的方法为例。胞外囊泡是由脂肪分子构成的膜状结构，其大小一般为人体细胞的千分之一。它可以运输RNA，并保护RNA不被体液中的RNA酶降解。通过对囊泡相关的约1700个实验进行分析，研究者们发现仅从体液中提取囊泡的方法就超过了1000种。这些方法的区别往往很小，比如用于样品离心的转子型号等。但该项目的研究者An Hendrix指出，“这些差别看似微小，但却会对提取的囊泡造成很大的影响。”An Hendrix同时也是比利时根特大学的一位研究胞外囊泡的癌症生物学家。
在过去五年中，exRNA诊断的相关研究越来越多，与之对应的是大学和公司都想要将这些成果转化为可应用的医学技术。目前生物机制和实际应用两方面均取得一定进展，因此科学家们开始探索RNA如何感知自身是否被包裹在囊泡或其他载体中，以及RNA在不同生理或病理条件下发挥的作用。
另一方面，得益于诸如胞外RNA通讯联盟（Extracellular RNA Communication Consortium, ERCC）这样的相关倡议，exRNA检测的标准度和重复性正在不断提高。该联盟由美国国立卫生研究院（US National Institutes of Health, NIH）于2013年发起，是一个耗费1.6亿美元、跨度十年的项目，旨在促进基于exRNA的诊断和治疗方法的临床研发工作。
尽管这些方法要应用于临床实践，还存在诸多困难，例如如何获取高纯度的囊泡等。但也有一些基于体液中exRNA的液体活检方法已经进入市场，可以为癌症诊断结果不明的病人提供更多有用信息。以同样的思路，可以针对其他疾病开发出对应的RNA分子探针。
Danilo Tagle是一位分子遗传学家，同时也在NIH属下的美国推进转化科学中心（National Center for Advancing Translational Sciences）马里兰贝塞斯达分部工作。他是负责特殊项目的副总监，目前正在帮助ERCC进行协调组织工作。Tagle表示，“这个行业发展十分迅速，这推动着各公司将其中一些方法尽快商业化。”
体液检测
在马萨诸塞州沃尔瑟姆市的一个实验室里，技术员们每月通常需要处理上千个尿液样本。他们需要从每个样本中提取出所有的胞外囊泡，再从囊泡中分离出RNA。
这就是Exosome Diagnostics公司的所在地。它是Bio-Techne的下属公司，也是世界上第一家将基于胞外囊泡的诊断方法应用于临床实践的公司。这个方法被称为ExoDx，它是专门为血液中前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）含量略微偏高的老年男性设计的，可以帮助他们确定是否需要对前列腺进行活体组织检查。
前列腺活检需要将大头针头粗细的针插入到直肠中，然后吸取一小截组织。这个过程非常痛苦，并且有可能会出现出血、感染和与膀胱相关的后遗症。但如果不做前列腺活检，则很难判断血液中PSA含量为2-10 ng/mL的这部分人的健康状况。他们有可能患有高度恶性肿瘤，需要尽快切除；但也有可能只需要进行医学观察即可。根据目前的估计，处于这个“灰色地带”的人群中，含有恶性肿瘤的人数少于25%。
ExoDx旨在让更少的人经受活检以及后续的过度医疗的折磨。它需要对尿液中的胞外囊泡里含有的三种RNA分子进行量化检测。其中两种分别与原癌和抑癌基因有关，另一种则与前列腺癌发展所需的一个非编码RNA的基因有关。通过检测这些基因的相对活性，ExoDx可以预测检测者患有恶性前列腺癌的可能性。
在两项临床试验中，研究者对超过1000名PSA含量为中等水平的男性进行了ExoDx检测。结果表明ExoDx极为准确地分辨出了其中可能患有癌症并需要进行活检的人，以及病情较轻、可以继续观察的人。
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目前该公司正在积极开发其他临床领域的业务。包括正在研发的第二个基于胞外囊泡的尿液检测方法，它可以在术前预测肾移植受者对移植肾是否存在免疫排斥反应。另一个正在研发的血液检测，可以基于exRNA和循环肿瘤基因（circulating tumour DNA），检测肺癌病人存在的基因突变。正如Exosome公司的联合创始人和首席科学官Johan Skog所说，“这不仅仅是一种诊断方法，这是一个平台。”
也有许多其他分子诊断公司和学术研究团队想要将exRNA用以识别癌症的早期征兆或者辅助进行疾病的危险度分层。例如位于加利福尼亚州森尼韦尔市的Cepheid公司以及位于新西兰达尼丁市的Pacific Edge公司，它们可以通过检测尿液中五种编码RNA的含量，筛查早期膀胱癌或者监测术后复发的预兆。该方法与Exosome的尿液检测方法思路一致，都是通过收集肿瘤源附近的体液，然后检测其中癌症特异性的RNA分子。相同的方法也被用于检测脊髓液中脑癌相关的RNA分子以及唾液中口腔癌相关的RNA分子。但也有一些肿瘤会将RNA分子扩散至全身。
对这些扩散至全身的RNA分子，大多数团队都想在血液中进行检测。但加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles）的口腔生物学家David Wong却表示这些RNA在唾液中也能被检测到。通过与首尔三星医学中心（Samsung Medical Center）的临床研究者合作，Wong对约2500名受试者的唾液进行了检测。结果表明，唾液中含有的九种人体或细菌来源的RNA，可以用于预测检测者患胃癌的可能性。后者是目前韩国最常见的癌症类型。
唾液检测
如果我们的眼光不仅仅局限于目前常用的体液检测的话，那么除exRNA外的其他分子或许同样可以用于医学诊断。正是基于这样的思路，位于美国加利福尼亚州南旧金山的Freenome公司正在尝试采用多组学的方法。除了血液中的RNA之外，他们还将对蛋白质、DNA、表观生物标志物以及其他的疾病循环标志物进行检测。通过这样的方法，他们希望能够获取癌症全方面的生物特征，从而解决结肠癌早期筛查中存在的问题——目前用于结肠癌早期筛查的肠镜，由于侵入性强、较为痛苦，所以很多患者不愿意进行检测。
“我们需要尽可能地结合多种诊断方法，”Freenome公司的首席科学官Jimmy Lin表示。“单一的标志物反映的信息不够全面”，因此很难通过一种物质来进行癌症诊断。
在今年的某个会议上，Freenome公司的科学家们介绍到，他们通过机器学习算法搭建的平台，可以对大量的生物数据进行筛选，并最终选出其中超过90%的结肠癌病例。其预测性甚至好于最近通过批准的一项粪便检测方法，该方法也是目前肠镜的唯一替代方法。
也有一些新兴的公司，尝试将exRNA用于心脑疾病领域。例如，马萨诸塞州列克星敦市的Dyrnamix公司就正在研发一种可以为心血管疾病患者提供个性化疗法的exRNA诊断技术。与此同时，离纳蒂克不远的Neurodex公司，正在尝试从血液中分离神经元产生的外泌体，并提取其中的RNA和蛋白质进行检测，希望能够找到阿尔茨海默病的早期标志物。
Johan Skog正在马萨诸塞州沃尔瑟姆的Exosome公司中处理样本。
图片来源：Johan Skog，Exome Diagnostics
Neurodex的首席科学官、神经学家Erez Eitan表示，“总的说来，研究神经的人不太喜欢RNA。”他解释道，与癌症不同，神经疾病的病理学特征不在DNA或RNA层面，而主要在蛋白质层面。所以研究者们对RNA在神经退行中的作用知之甚少。
这部分解释了为什么用于阿尔茨海默病前期诊断的大多血液检测方法，都是测量淀粉样蛋白、活化tau蛋白以及其他在大脑中积累并造成这种疾病的蛋白。但这就像是通过翻找一个人的垃圾桶，来判断他的生活方式，Victoria Risbrough表示。Risbrough是一名神经学家，在美国退伍军人事务部（Veterans Affairs）属下的应激与心理健康卓越中心（Center of Excellence for Stress and Mental Health）工作。她认为要了解这些疾病，更好的方法是通过相关细胞间的信息交流方式，而这恰恰是exRNA的功能。
“RNA可以让你知道什么是造成病理现象的可能原因。”Risbrough表示。目前她正在与加州大学圣迭戈分校的神经病理学家Robert Rissman合作，共同开发一项用于创伤性脑损伤的诊断方法。“我们不是翻找垃圾桶，而是直接看它们之间交流的信息。”
附加价值
尽管开发出一种能对脑部疾病进行全面筛查的检测方法，仍然是最终的目标，但新泽西州蒙默斯汇合站的DiamiR公司共同创始人和董事长Kira Sheinerman表示，对实验性疗法进行临床试验的医药公司可能会成为大多数exRNA诊断的首批客户。
DiamiR公司在血液中找到了与炎症相关的microRNA，并且该RNA分子在大脑中含量较高。通过检测microRNA的含量，他们可以预测目前没有认知障碍的老人，在未来是否会罹患阿尔茨海默病，其准确度可达到84%。Sheinerman表示，药物开发者和临床研究者可以利用该检测，来辨别出处于阿尔茨海默病前期的患者，并邀请他们作为正在评估的实验性疗法的志愿者。
另一方面，即使这些exRNA检测最终没有被广泛使用，“它们仍然可以帮助我们对疾病建立新的假设。”神经学家Jeseph Quinn表示，他目前在位于波特兰的俄勒冈健康与科学大学（Oregon Health and Science University）工作。Quinn与分子神经生物学家Julie Saugstad合作，发现了一系列可用于诊断阿尔茨海默病的microRNA。这些RNA分子可以作为新的分子靶点，用于新药的研发。但同时Quinn也表示，其发挥作用的具体生物机制仍未被阐明。因此，和大多数的研究者一样，他们对exRNA诊断的研究仍然处于初期探索阶段。
目前该领域的研究问题之一，就是如何更好地分离胞外囊泡。尽管一些研究者已经可以不经胞外囊泡，直接获得exRNA，但这种方法常常会在分析RNA时，遗失一些细节。因此，研究者们正在逐渐抛弃对人体体液进行全RNA测序的方法，而更倾向于对目标器官分泌的囊泡中的RNA进行精准分析。“这种方法可以直接锁定信息来源。”Dyrnamix公司共同创始人，也是波士顿马萨诸塞州总医院（Massachusetts General Hospital）的心脏电生物学家Saumya Das表示。
由于不同分子在尺寸和密度上都有差异，所以科学家们通常会通过离心来分离得到胞外囊泡。但这个方法也存在缺陷。“在离心时会有一些污染，所以我们不能通过离心获得100%纯度的囊泡。”荷兰乌得勒支大学（Utrecht University）的免疫细胞学家Esther Nolte-'t Hoen表示。
目前研究者们正在开发分离胞外囊泡的新方法。例如通过大小不同的小孔过滤得到囊泡，或者利用亲和性物质，结合样品中的囊泡以实现分离。但无论是哪种方法，都需要一种标准参照物来进行校准，而这最近才得以实现。
去年，根特大学的Hendrix和她的同事研发出了一种可追踪的工程化胞外囊泡。将其注射进体液中，并进行追踪，就可以验证样品制备和分析方法的准确性。“长期以来，这个领域都在寻找这样一个标准参照物。”Hendrix表示。她将这种可追踪的囊泡分享给了许多实验室，“每次我参加会议，展示这一技术时，都有许多人请求我分享这一技术。”
Hendrix、Nolte-'t Hoen以及其他研究者都积极地参与到社区建设和数据记录的相关倡议中，以确保疾病诊断等关于含有RNA的胞外囊泡的研究，可以被恰当地诠释和重复。“这或许不是科学意义上最令人兴奋的那些事，但却是必不可少的一部分。”Nolte-'t Hoen表示。
同时，NIH通过其数亿美元的项目，正在寻找更好的分离特定的胞外囊泡并分析其中RNA分子的方法。目前正在研发的exRNA诊断中很少能达到这个精确度，甚至其中大部分都不需要对胞外囊泡进行提纯，这种纯度对临床应用来说是可以接受的。
但Tagle表示，“为了说明研究的严谨性，科学家需要知道为什么会出现这样的结果。这就会让研究者更加注重实验过程，从而产生更可靠和可重复的结果。”
作者：Elie Dolgin是马萨诸塞州萨默维尔市的一名科学记者。
翻译：洪艺瑞
审校：潘燕婷
引进来源：科学美国人
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