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《张江科技评论》

开博时间:2019-06-06 14:03:00

《张江科技评论》是由上海科学技术出版社与上海市张江高科技园区管理委员联合创办的一本科技评论类杂志。该刊报道评价国内外创新性科学技术的发展趋势及其商业价值,介绍上海在建设全球领先科创中心进程中的制度成果、技术成果、创业成果,推动产学研密切协作,促进科技成果转化,服务经济转型发展。

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斩获诺贝尔奖:重写生命的基因剪刀

2021-02-02 16:17:00

  CRISPR/Cas9基因编辑技术自诞生以来迅速发展,目前已经成为生命科学、医学等领域最耀眼、最有前景的技术之一。2020年诺贝尔化学奖授予CRISPR/Cas9技术无疑将再次掀起一场生物技术革命。


  北京时间2020年10月7日下午5时48分,瑞典皇家科学院宣布,2020年诺贝尔化学奖授予第三代基因编辑技术——CRISPR/Cas9系统的发现者,德国马克思?普朗克生物感染研究所的科学家埃马纽埃尔?沙尔庞捷(Emmanuelle Charpentier)和美国加利福尼亚大学伯克利分校的科学家珍妮弗?杜德纳(Jennifer Doudna)。她们的研究成果被誉为掀起一场生物技术的革命。此前,凭借开发出基因编辑工具CRISPR/Cas9,两位杰出的女性科学家已经共享了2015年度生命科学突破奖、2015年度遗传学格鲁伯奖、2016年度加拿大加德纳国际奖(与张锋共享)和2020年度被誉为诺贝尔奖风向标的沃尔夫医学奖。


  CRISPR/Cas9系统的发现之路

  沙尔庞捷,1968年生于法国尤维斯,1995年博士毕业于法国巴黎巴斯德研究所,2002年开始建立独立研究组,主要研究人类感染相关的病原微生物——化脓性链球菌。研究过程中沙尔庞捷注意到细菌中存在许多小RNA分子,其序列与诸多真细菌(Bacteria)和古细菌(Archaea)基因组中包含的重复性核苷酸类似。多年来,沙尔庞捷一直致力于研究这些小RNA分子如何调控细菌的生理过程,她发现这些小RNA分子(CRISPR RNA和tracrRNA)与一种称为Cas9核酸酶的DNA切割酶相互作用能够定向切断细菌的基因组DNA,相关研究成果于2011年发表在《自然》(Nature)杂志上。

  杜德纳,1964年生于美国华盛顿特区,1989年博士毕业于美国波士顿哈佛医学院,2002年进入美国加利福尼亚大学伯克利分校,一直从事RNA分子研究。得益于杜德纳求学阶段的广泛涉猎,2005年她从地球和行星科学教授吉莉恩?班菲尔德(Jillian Banfield)处获知,进化关系差异极大的多种细菌和古细菌的基因组DNA中包含大量相同的重复序列,序列中间有部分区段与病毒相似。于是,科学家推测这是简单单细胞生物细菌和古细菌的“免疫系统”,也就是说,这些细菌当受到细菌性病毒感染后,会将来自病毒的部分序列整合到自身基因组中,以抵御病毒的再次入侵。不过,最初科学家以为这些片段与RNA干扰相关。杜德纳则另辟蹊径,发现了细菌基因组中另一群编码与DNA切割蛋白同源的基因Cas,并证实其具有切割细菌DNA及病毒DNA的能力。

  2011年,沙尔庞捷和杜德纳开始合作研究CRISPR系统,纯化出Cas9核酸酶,并证实了CRISPR/Cas9系统的工作方式:作为细菌免疫系统的一部分,CRISPR系统能产生携带病毒遗传信息的RNA序列,该RNA序列可以引导Cas9核酸酶在细菌DNA分子上找到入侵的病毒DNA序列,并经tracrRNA介导切割目的区域的DNA序列。该研究成果于2012年发表在《科学》(Science)杂志上。CRISPR/Cas9系统在细菌应对病毒感染中行之有效,但真核生物的DNA双链被切割后仍旧能被复杂的修复系统恢复,所以并不会被摧毁。不过,DNA双链断裂后的修复阶段为科研人员对DNA进行加工和操作带来了可能。据此,研究人员设计出第三代基因编辑技术,将guide RNA和tracrRNA相连组成单一的引导RNA,进一步简化了CRISPR/Cas9系统。

  事实上,CRISPR/Cas9系统并非首个被设计出来的基因编辑工具系统。基因编辑从技术上来说是定点突变,是为了获取目标性状而精准和定向改变目标DNA的一门技术。如果说“物竞天择,适者生存”是大自然对随机突变基因库的定向选择,那么,人类为了满足自身需求对作物和牲畜的驯化和杂交也称得上无意识的“广义的基因编辑”。但是,这种策略获得基因融合的过程往往需要多代杂交和长时间的选育。

  近几十年来生物学的迅猛发展给高效、精准的定点基因编辑带来了可能。锌指核酸酶ZFN(zinc finger nuclease)是第一代基因编辑工具,其主要功能结构包括1个核酸内切酶FokⅠ和用于识别DNA的锌指蛋白。工作时,ZFN首先特异性地识别一段DNA序列,再由核酸内切酶FokⅠ切断DNA。转录激活因子样效应物核酸酶TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技术是第二代基因编辑技术。黄单胞菌自然分泌的蛋白TALEs能特异性识别不同的碱基对,而TALEN技术就是通过一串TALEs识别特异性DNA序列,再利用核酸内切酶FokⅠ进行准确切割。前两代基因编辑技术有着共同的缺点,就是对DNA序列的识别依赖于蛋白质,难以应对复杂的特异性DNA序列,设计和操作相对困难,且效率不高。

  CRISPR/Cas9系统创新性地使用RNA作为序列识别向导。由于RNA与DNA严格匹配,技术简单且廉价,编辑高效、精准,CRISPR被称为编辑基因的“魔剪”,已深入基础研究的各个领域,并开始进入应用阶段。可以预见,未来CRISPR/Cas9系统还将在更多领域给人类的生活带来深远的影响。

  CRISPR的历史和发展

  实际上,CRISPR序列是1987年由日本Nakata研究组的分子生物学家石野良纯(Yoshizumi Ishino)首次发现的。在其后的十多年间,多位科学家发现有20多个细菌和古细菌中都包含该序列。2002年,生物信息学分析发现这些序列仅存在于真细菌域和古细菌域中,在真核生物域和病毒中是不存在的。随后,研究人员将其定名为CRISPR。同时,科学家还发现了这些区段周围的几个同源基因,并将其命名为Cas。直到2005年,3个研究组发现CRISPR中的间隔序列来自外来病毒,并证实病毒无法感染携带有与病毒同源序列的细胞,研究提示CRISPR参与细菌免疫。

  2012年,沙尔庞捷和杜德纳开创性地阐释了CRISPR/Cas9系统的生化机理。2013年年初,美国哈佛大学医学院的乔治?丘奇(George Church)、麻省理工学院博德研究所的张锋、加利福尼亚大学旧金山分校的齐磊(Lei S. Qi)分别在《科学》(Science)和《细胞》(Cell)杂志上发表针对CRISPR/Cas9系统改造研究的论文,并成功地将CRISPR/Cas9系统运用到真核生物(哺乳动物)细胞中。其中,张锋将Cas9改造成缺口酶,大大促进了产生的双链断裂处的DNA修复过程,成为后来定点突变的最通用体系。齐磊通过突变掉Cas9的核酸内切酶形成dCas9,通过改变向导RNA的靶向区域达到抑制或者激活转录的目的。之后的几年内,针对CRISPR/Cas9系统的缺陷和局限性,如脱靶率高等问题,科学家仍在不断改进。

  丘奇和张锋首创性地将CRISPR/Cas9系统应用在活体细胞中,且申请并获得了专利。在巨大的应用前景前,CRISPR/Cas9系统的专利权大战也随之展开。2014年,张锋获得了美国专利商标局(USPTO)批准的CRISPR基因编辑技术的专利申请;2020年9月10日,美国专利审查与上诉委员会(PTAB)发布称,来自麻省理工学院博德研究所的张锋团队具有在真核细胞中使用CRISPR技术的专利优先权,但2位诺贝尔奖获得者——沙尔庞捷和杜德纳所带领的德国马克思?普朗克生物感染研究所和美国加利福尼亚大学伯克利分校的研究团队在CRISPR的核心使用技术上也可能获得专利权,暗示了CRISPR的专利权大战仍未休止。当然,关于诺贝尔奖归属问题,在学术界同样存在争论。曾有学者认为,沙尔庞捷和杜德纳的贡献是在生物化学领域,应获得诺贝尔化学奖,而诺贝尔生理学或医学奖则应颁给乔治?丘奇和张锋,以表彰他们在医学应用上的贡献。如今诺贝尔化学奖的确花落沙尔庞捷和杜德纳,而本届生理学或医学奖并未授予CRISPR系统。

  CRISPR/Cas9系统的前景和隐患

  从CRISPR系统的发现到斩获诺贝尔奖,CRISPR/Cas9系统仅仅走过了8年。事实上,CRISPR/Cas9系统也是最快走向应用的生物化学/医学发现之一,在基础研究层面极大地促进了基因功能研究。早在2013年5月,鲁道夫?耶尼施(Rudolf Jaenisch)研究组就已经利用CRISPR/Cas系统制造了基因缺陷小鼠。但是,在2013年前要想制备一个基因编辑细胞还非常困难,需要一定的资金、大量的背景群体和较长的时间。随着我国经济、文化和科技的飞速发展,我国基础医学和生物学领域研究突飞猛进,在许多方面已经迎头赶上甚至超越国外同行。2013年至2015年,张锋的CRISPR/Cas9系统在我国实验室的使用已经非常成熟,在细胞中定点敲除1个基因只需要1~2星期。2013年12月,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所的李劲松研究员就已经将CRISPR/Cas9系统与显微注射结合,实现从合子就开始突变的转基因小鼠“量产”。截至目前,科研人员已经实现了对果蝇、线虫、小鼠、大鼠、猪、羊、猴、水稻、小麦、高粱等多种生物的基因编辑。

  与此同时,CRISPR在应用领域更是前途广阔。在不受伦理困扰的农业、畜牧业领域,育种专家们利用CRISPR/Cas9系统定点编辑抗病等基因,实现了传统方法难以匹敌的高效育种。在人类疾病研究模型鼠、模型猴身上,科学家利用CRISPR/Cas9系统治愈了白内障等疾病。2016年,首例利用CRISPR/Cas9系统治疗人类疾病的临床试验在四川大学华西医院开展,该临床研究是利用CRISPR/Cas9系统使细胞中的关键性抑制因子PD1发生免疫,再将编辑过的免疫细胞进行体外培养扩增后重新回输至肿瘤患者体内。然而,科技是把双刃剑。2018年11月,南方科技大学副教授贺建奎利用CRISPR/Cas9系统编辑的人类胚胎出生,舆论一片哗然,更引发国内外有关学术道德和医学伦理的广泛讨论,“CRISPR/Cas9”“基因编辑”这些基础研究领域的专有名词也首次进入大众视线。造福人类的同时必须规避滥用风险,CRISPR/Cas9系统这一强大工具更需要强有力的伦理监管。

  牛宁宁,上海交通大学医学院附属仁济医院副研究员。

  文/牛宁宁

本文来自《张江科技评论》

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