随着单碱基基因编辑工具的进一步完善，它将在人类的遗传性疾病的基因治疗中发挥越来越多的作用。

　　生命的遗传物质是DNA。基因好比是一串由DNA碱基“字母”拼起来的词句，构成了生命的“遗传天书”。如果“字母”出错，基因就不能正常行使功能，甚至产生有害的功能，引起各种各样的疾病。而“遗传天书”中的错误，既有单个字母的“错字”，也有成千上万个“字母”的缺失。自从人类基因组计划完成以来，人类第一次完全破译了DNA的“遗传天书”，疾病的遗传学基础一一被阐明，如何修复这些疾病相关的“错误”，是科学家面临的新的挑战。

　　近年来基因编辑技术的发展，首次使DNA可以直接成为药物开发的靶标，修复“遗传天书”中的错误，从而根治一些疾病，尤其是单基因遗传性疾病。现在最常用的CRISPR/Cas9基因编辑技术，好比是一把可以精确控制的“剪刀”，将“剪刀”精确定位到某些区域内的基因上，同时提供正确的修复模板，用以实现突变基因的修复。然而，“剪刀”也会造成目的基因的破坏和删除，无法同时实现精确和高效修复的目的。为开发更好的基因编辑方法，近年来，科学家逐步把单一功能的CRISPR “剪刀”, 改造成多功能的“瑞士军刀”。例如，单碱基基因编辑技术，利用CRISPR的精准定位功能，招募特定的碱基修饰酶，就可以直接对单个“字母”进行修改，完成单碱基的基因编辑，治疗单个“字母”错误造成的疾病。此外，研究还发现，精确地针对某些“字母”进行置换，也可以修复上万个“字母”缺失造成的疾病。因此，这一技术有可能在人类疾病治疗中得到广泛的应用。

　　CRISPR/Cas9基因编辑技术

　　CRISPR/Cas系统是细菌中的适应性免疫系统, 原本是细菌用于降解噬菌体DNA的机制。经过遗传工程改造的CRISPR/Cas9系统仅包括1个Cas9 蛋白和1条向导RNA(sgRNA),在sgRNA的定位下, Cas9蛋白可以像剪刀一样, 对靶向DNA进行切割。利用CRISPR/Cas进行基因编辑，只需提供20 个碱基对的特异性核酸序列，因此，其构建过程相对之前的基因操作技术更加简单、快捷，适合规模化、高通量的组装，操作简单，制作成本低，受到越来越广泛的应用。尽管具有很多优势，但常用的CRISPR/Cas系统也存在一些缺点。

　　首先，利用CRISPR/Cas9技术进行修复突变的效率较低。CRISPR/Cas9主要采用同源重组的方式，同源重组主要发生在细胞分裂的DNA复制前期和复制期，因此在不分裂的体细胞中，同源重组基本上无法实现。此外，基于CRISPR的基因编辑依赖于对DNA双链的切割，而DNA断裂造成的损伤可能造成哺乳动物细胞癌变;在一些细胞中，DNA断裂可造成细胞死亡，使依赖于CRISPR酶切活性的基因编辑无法实现。

　　其次，CRISPR/Cas9不仅靶向编辑目标DNA位点，而且会切割那些与靶位点序列相同(或高度相似) 的其他DNA位点，使其产生突变，即脱靶效应。脱靶效应是CRISPR/Cas9基因编辑技术所面临的最主要问题。由于Cas9蛋白对sgRNA序列与靶位点间的错配不完全敏感，其脱靶风险较高。

　　基于以上原因，现在的CRISPR/Cas9技术应用大多针对细胞系或体外培养的干细胞，或者对模式生物进行基因编辑，对于大部分的体细胞只能进行基因敲除，无法精确地进行基因修复。现阶段利用CRISPR基因编辑技术开展疾病治疗，也主要是利用非同源末端连接的修复模式。

　　基于靶向性胞嘧啶脱氨酶的单碱基基因编辑技术

　　在哺乳动物细胞内，大部分细胞的同源重组效率很低，这决定了现在的CRISPR技术只能进行有效的“删除”，无法对DNA序列进行高效的“替换”。但是，在免疫系统中有一个高效的DNA突变体系，也就是抗体蛋白的亲和力成熟过程。免疫球蛋白进行高频突变，对编码的DNA序列进行随机“替换”，获得高亲和力的抗体。研究发现，这一过程主要由一个胞嘧啶脱氨酶(AID)介导。通过高频突变，抗体分子的氨基酸序列发生随机改变，经过正向选择使含有高亲和力抗体的B细胞选择性扩增，对此过程进行迭代，最终演化出高亲和力的抗体。

　　基于AID可以进行高效的诱导突变，将DNA序列进行“替换”，提示我们可以将这一特点和CRISPR相结合。我们发现，将dCas9和AID融合，可以利用dCas9的靶向功能，把AID蛋白招募至细胞内源的DNA上，在任何感兴趣的位点诱导高频突变。我们证明dCas9-AID融合蛋白(TAM)具有多个独特的功能，包括：(1)胞嘧啶可以随机地向其他3个碱基转变;(2)dCas9-AID融合蛋白的活性只依赖于sgRNA，与AID识别的一级序列无关;(3)dCas9-AID可以同时诱导多个胞嘧啶的突变，并且这一方法不依赖于DNA切割和修复，可以大幅提高单碱基精确编辑的效率，避免了DNA的双链断裂;(4)在一种多肽抑制剂(uracil glycosylase inhibitor，UGI)存在的情况下，TAM可以诱导胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)转变，并且其活性只局限于前间隔序列(protospacer)内的特定碱基; (5)利用dCas9-AID可以有效地预测出小分子抑制剂的耐药性突变。作为遗传操作的新技术，靶向性胞嘧啶脱氨酶有着广泛的应用前景，可以为分子进化、基因治疗和在单碱基水平上分析基因调控元件等领域提供新的方法。

　　除了最初的胞嘧啶单碱基编辑之外，美国哈佛大学的科学家还通过蛋白人工进化，开发出了针对腺嘌呤的单碱基编辑，可以将A转化为G;麻省理工学院的科学家将靶向RNA的CRISPR蛋白Cas13a和腺嘌呤脱氨酶ADAR融合，用于在RNA上诱导A到G的突变。

　　很多人类疾病，都是单碱基突变造成，因此通过单碱基基因编辑，修复错误的碱基，可以直接应用于这些疾病的基因治疗。但是，现在的单碱基编辑平台仍然不够准确，往往会在临近的2～3个碱基同时造成突变，有可能会引起其他意想不到的后果。因此，对靶点的选择和治疗方案的设计，都需要认真的考量。另外，即使同一种遗传疾病，不同患者往往有不同的致病突变，有可能需要对每个患者开发特异的治疗方案，全面衡量其效率，这从经济上和成本上都面临巨大的挑战。

　　利用单碱基基因编辑技术修复RNA剪接缺陷

　　在真核细胞中，基因在转录后还受多种不同机制的调节，包括可变剪切、差异化3’聚腺苷酸化、微小RNA介导的基因沉默等。据估计，超过75%的人类基因具有一种以上的信使RNA(mRNA)剪接方式，其中大部分可以翻译为功能性蛋白质，与RNA表达的组织特异性一起，共同造成转录组的组织特异性，介导细胞的分化，赋予不同细胞截然不同的功能，是决定细胞命运的重要环节。因为RNA剪接的重要作用，mRNA剪接的异常是许多疾病的直接诱因，估计35%～50%的人类疾病是由基因剪接异常造成。

　　针对RNA剪接过程进行修复是很多遗传疾病的治疗靶点。现有的调控RNA剪接的方法是通过反义寡聚核苷酸(ASO)。ASO经过特殊修饰，通过互补配对结合到RNA上后，不诱导RNA的降解，而阻断相应蛋白和RNA的相互作用，调控RNA的剪接。但是，因为RNA二级结构的影响，往往需要对ASO进行大量筛选，才能获得有效的调控特定RNA剪接的ASO序列。

　　利用ASO调控RNA剪接，针对一些遗传疾病，最近获得了一些成功：在临床试验中，对杜氏肌肉萎缩症 (DMD)和脊髓性肌萎缩症 (SMA)都有一定的缓解作用。然而，ASO疗法也面临一些内在的挑战，例如，大部分ASO只能有效地靶向到肝脏，无法通过血脑屏障，修复神经细胞;因为ASO作用到RNA，其作用是瞬时的，需要持续给药;ASO的合成需要复杂的修饰，因此临床应用价格昂贵(约20万美元/年);更重要的是，一些ASO疗法的效果十分有限, 例如针对杜氏肌肉萎缩症的ASO只能恢复约1%的肌萎缩蛋白表达。因此，无论从科学研究还是临床应用角度，都亟须开发出新的调控RNA剪接的基因编辑方法。

　　绝大多数基因中内含子的剪接位点由GU-AG构成，我们发现并证明可以利用之前开发的单碱基基因编辑，将内含子剪接位点的鸟嘌呤(G)突变成腺嘌呤(A)，使这一剪接位点不能被剪接体识别，从而特异性阻断外显子识别，调控内源性mRNA的剪接。通过这一策略，有望针对多种RNA剪接缺陷造成的疾病起到治疗作用。

　　例如，杜氏肌营养不良症是一种致命的遗传疾病，每4000名男性中就有一人患有此遗传疾病。DMD的发病机理很简单，由于遗传突变破坏了DMD基因读码框，或产生提前终止密码子，造成肌萎缩蛋白的完全缺失，引发肌肉萎缩和瘫痪，最终造成心脏或肺功能的衰竭。过去研究证明，如果通过外显子跳跃，恢复蛋白读码框以产生内部截短的Dystrophin蛋白，可以用来治疗DMD。在我们前期的研究中，建立了DMD患者来源的诱导型多能干细胞。这个患者因为DNA大片段的缺失，超过1万个碱基的缺失，造成了DMD基因的移码突变和肌萎缩蛋白的完全缺失。我们通过设计基因编辑策略，在剪接位点精确地诱导了鸟嘌呤到腺嘌呤的突变，造成相应外显子的跳读，恢复了mRNA的读码框和肌萎缩蛋白的表达。进一步在体外分化的心肌细胞中证明心肌细胞的缺陷被完全修复。更重要的是，通过全基因组测序，只发现了一个脱靶位点，其位于基因间区域，对周围的基因编码和表达都没有影响。除此之外，我们还证明类似的策略可以用于多种RNA剪接疾病的治疗。

　　单碱基基因编辑的应用，现在还处于起始阶段，随着对这一工具的进一步完善，它将在人类的遗传性疾病的基因治疗当中发挥越来越多的作用。

　　常兴，中国科学院上海生命科学研究院研究员。

本文来自《张江科技评论》