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植物基因是如何转移的?

2015-05-15 15:55:53

植物基因是如何转移的?

■ 冬雪

 

把一种外源性基因转移到另一种原来并不含这种基因的生物体内是基因的拼接和重组,也就是转基因,这种技术是基因工程的一种形式。目前的转基因主要分为对植物基因和对动物基因的转移两大类。本文描述的是植物转基因。

 

转移植物基因的两种方法

一种或多种外源性基因是如何转入另一种植物(作物)体内的呢?可以用一种通俗的比喻来解释。

例如,人类社会是由无数个家庭组成的,每个家庭都有固定的家庭成员,除了血缘的紧密纽带关系外,还有经济和其他的关系把家庭成员固定在一起,家庭成员不会轻易分离,同时一个家庭也不会让陌生人进入。一旦有另一名成员进入一个稳定的家庭,除非是特别亲近的亲属关系或收养关系,都会受到这个家庭成员的排斥,不可能被这个家庭接受,所以被称为“第三者”。

一种植物体内的染色体(DNA)中的基因也是固定的,轻易不能分开和分解,一个或几个外源性基因就是第三者,一般是不会被一种受体植物所接受的,如果受体植物发现了外源性基因,就会用自身的武器,如DNA酶来降解(杀灭)外来基因。因此,为了有效转移外源性基因,如将外源性的抗虫基因——苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt基因)转移到棉花中,就得采取两种办法。一种是载体转移(包装法或间接法);另一种是直接转移,或强行转移。

用载体作为媒介进行基因转移就是将目标基因连接或包裹于某一载体DNA中,载体通常是微生物,然后通过载体感染受体植物,将外源性基因转入植物细胞。直接转移是利用植物细胞生物学特性,通过物理、化学和生物学方法将外源性基因转入植物细胞。

所以,前一种方法是包装法,也是一种蒙蔽或欺骗方法;后一种方法是强硬的,有一点像陌生人或强盗强行闯入别人的家庭,并登堂入室,占据主要位置,或者说反客为主。

 

载体转移

载体转移又称为农杆菌载体转移。20世纪70年代末80年代初,研究人员发现,野生型Ri(根诱导)和Ti(瘤诱导)质粒可以转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株,此后,以Ti质粒为载体的植物转基因技术逐渐得到应用。今天,农杆菌介导的转基因法是最主要的一种载体转移方法。利用经过改造的农杆菌TiRi质粒为载体可以高效地转移外源性基因。

农杆菌是一种在土壤中生活的微生物,分为根癌农杆菌和发根农杆菌,它们的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒。根癌农杆菌中的Ti质粒可以转化植物细胞而产生冠梁瘤,发根农杆菌的Ri质粒可以侵染双子叶植物而产生大量的不定根(或称之为毛状根)。

无论是Ti质粒还是Ri质粒,其上有一段转移DNAT-DNA),农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将转移DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代,这就让农杆菌可以把一种或多种外源性基因转移到某种受体植物中。

最初研究人员发现,当植物受到损伤时,伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物,因而吸引农杆菌移向这些细胞,这时农杆菌中Ti质粒上的转移DNA转移到受伤的植物细胞(受体细胞),并且整合到受体细胞染色体的DNA中。在自然条件下农杆菌只是感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力。

因此,如果将一段目标基因(外源性基因)插入到Ti质粒的转移DNA上,通过农杆菌的转化作用,就可以使目标基因进入受体植物细胞,并将其插入到受体植物细胞的染色体中,使目标基因的遗传特性得以稳定维持和表达。抗虫的Bt基因就是这样被转移到棉花或玉米中的。当然,农杆菌介导法起初只用于双子叶植物的基因转移,但是,近年来随着基因工程技术的发展,农杆菌介导的转基因也在一些单子叶植物,尤其是水稻中得到广泛应用。

利用载体对植物进行外源性基因的具体转移过程如下:

一是获取目标基因,即在目标基因被克隆后,用限制性核酸内切酶切割下目标基因。

二是把目标基因与载体相连(构建载体),即用DNA连接酶将目标基因与载体(大多数选用质粒)连接起来。

三是将目标基因导入载体细胞,即把含目标基因的重组质粒导入农杆菌细胞。

四是对目标基因进行检测与鉴定,用DNA分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术进行个体生物学水平鉴定,以确定农杆菌细胞中是否包含目标基因。

五是将成功表达外源性基因的农杆菌细胞导入受体植物(如棉花)内,然后再对受体植物进行目标基因的生物学鉴定,如果受体植物中有目标基因的表达,说明转基因获得成功。

目前,利用农杆菌载体进行外源性基因的转移是采用得最多的植物转基因方法。当然,除了Ti质粒和Ri质粒为载体的基因转移外,还可以用脂质体为载体进行基因转移。脂质体是由磷脂组成的膜状结构,因此可将目标基因包装在脂质体内以避免受体植物细胞中的DNA酶将目标基因降解,从而保证目标基因转入到受体植物的细胞中。

所以,无论是利用农杆菌载体进行转基因,还是利用脂质体为载体进行转基因,都是通过包装的方法进行基因的转移,也能避免受体植物中的DNA酶排斥外源性基因。

 

直接转移

把外源性基因直接转移到另一种植物中也是一种强行转移。这正如陌生人要进入一户人家,没有钥匙进不了门,没有经过主人允许和开门也进不了门。但是,还有一种方法能进门,即强行入门,强行的方法就包括,撬掉门锁、敲碎窗户以及翻墙进入等。外源性基因的直接转移就是如此。

直接转移一种外源性基因到受体植物中也有多种方法,包括电穿孔法、基因枪法和微注射法(子房注射法)等。

1.电穿孔法

电穿孔法指的是,细胞在外加高压电脉冲电场的作用下,细胞膜表面产生疏水或亲水的105115微米微小通道,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如基因片段可通过这种微小的通道进入细胞,因此能把外源性基因转入受体植物体内。

现在,这种方法已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物的基因转移,同时也应用于动物的基因转移。早在1995年,美国农业部研究所就用这种方法把两种着色剂——锥虫蓝和荧光素二乙酸盐直接转入到大豆、紫花苜蓿、烟草3种植物的细胞中,并获得高水平的基因表达。到了20世纪80年代末,研究人员也用电穿孔法将新霉素磷酸转移酶基因转入玉米自交系的原生质体,从而生成植株。此后,抗草甘膦除草剂的转基因大豆、棉花、玉米和油菜等也相继问世并获得广泛种植,方法也是采用电穿孔法。

现在,抗草甘膦除草剂的转基因作物已成为全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦杀死杂草的原理在于竞争性抑制植物叶绿体或者质体中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS),这种酶是多种植物和杂草所共同拥有的。通过转基因的方法,让受体作物如棉花、玉米、大豆产生更多的EPSPS,就能抵抗草甘膦,从而让作物不被草甘膦除草剂杀死。有了这样的转基因棉花、玉米和大豆,农民就不必使用多种除草剂,只需使用草甘膦一种除草剂就能杀死多种杂草。

2.基因枪法

基因枪法又称粒子轰击技术,是用粒子枪把表面吸附有外源性基因的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于根癌农杆菌仅对某些双子叶植物敏感,而对多数单子叶植物不敏感,从而限制了根癌农杆菌Ti质粒介导法(农杆菌载体)转移基因。但基因枪法不受宿主限制,宿主既可以是双子叶植物,也可以是单子叶植物,它们也即受体植物。

基因枪法可控度高,同时不需要去除受体植物细胞的细胞壁,被转化的细胞或组织容易再生成植株。基因枪轰击过程中可根据需要将射弹射入特定层次(位置)的细胞,有利于提高转化效率。基因枪法操作简单、迅速,但费用较高。基因枪法主要用于转移植物基因,也可用于对动物、微生物等的基因转移。

现在利用基因枪法转基因技术获得的转基因园艺植物较少,只有杨树、云杉等,而获得的转基因水稻、玉米、烟草、大豆、木薯等作物较多。基因枪法现在还存在转化效率低、外源性基因向植物中插入不够精确和稳定性不高等缺点。

3.子房注射法

子房注射法也称微注射法。子房是被子植物生长种子的器官,位于花的雌蕊下面,一般略为膨大。子房里面有胚珠,胚珠受精后可以发育为种子。子房由子房壁和胚珠组成。当传粉受精后,子房发育成果实。子房壁最后发育成果皮,包裹种子,有的种类形成果肉,如桃、苹果等。

子房注射法就是使用微注射针或显微注射仪将外源性基因注入处于减数分裂期的受体植物的子房中,借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力,外源性基因可进入受精的卵细胞中,借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象,外源性基因被随机整合到受体作物的染色体上。

20世纪90年代,一些Bt转基因玉米就是用子房注射法进行转基因的,这种转基因玉米可以抗御玉米螟的啃食。目前,子房注射法成功用于玉米、甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种。

子房注射法的步骤是,制备目标基因;根据受体植物受精后其子房的变化特点,确定最佳时间进行外源性基因注射或将离体的受精子房进行外源性基因注射,再对该离体子房进行培养;转化种子及对后代的外源性基因和其表达产物进行分子检测。

子房注射法无需组织培养过程,操作过程简单、便捷,但田间转化过程的工作量大。转化过程中,子房受到机械性伤害易导致转化率和结实率低;易产生基因污染,而且该方法只能在授粉期进行,容易受季节和天气等自然条件影响。由于后代群体规模较大,筛选过程工作量较大。

 

【责任编辑】张田勘

 

 

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